Rekombinant Dna


(Bahtın Atakan Soysal) #1

Enzimatik katalizi, makromoleküler yapıyı, hücre metabolizmasını ve bilgi metabolik yollarım yöneten kuralların açıklanmasıyla çok karmaşık biyokimyasal süreçlerin araştırılması gerçekleşmiştir. Hücre bölünmesi, bağışıklık, embriyogenez, görme, tat alma, onkogenez, algılama tümü birden giderek daha iyi anlaşılır hale gelmekte olan moleküler ve makromoleküler etkileşimlerin ustaca senfonisinde orkestralaştınlmıştır. Ondokuzuncu yüzyılda başlayan biyokimya yolculuğunun gerçek sonuçları, canlı sistemlerin anlaşılması ve değiştirilmesinde gittikçe artan bir şekilde yerini bulmaktadır.

Biyokimya, karmaşık bir sürecin anlaşılması için bileşenleri in vitro olarak tek tek izole eder, inceler, soma parçaları bir araya getirerek tüm sürecin şeffaf bir görüntüsünü elde etmeye çalışır. Moleküler bilgi, hücrenin kendi arşivinde, DNA’smda yerleşmiştir. Ancak kromozomların büyüklüğü bir sorundur: memeli genomunda milyarlarca baz çiftinde yuvalanmış 100,000 gen arasmdan özel bir gen nasıl bulunacak ve incelenecektir? Yanıtlar 1970derde alınmaya başlanmıştır.

Genetik, biyokimya, hücre biyolojisi ve fizikokimya alanlarında çalışan binlerce bilim adamının elde ettiği onlarca yıllık gelişmeler Paul Berg, Herbert Boyer ve Stanley Cohen’in laboratuarlarında toplanarak çok daha büyük kromozomlardan çıkarılan küçük DNA parçalarının yerlerinin belirlenmesi, izole edilmesi ve araştırılması için özel tekniklerin geliştirmesinde kullanılmıştır. DNA klonlaması için teknikler, hemen her bilinen biyolojik süreçte rol oynayan genlerin tanımlanması ve araştırılmasında şimdiye dek düşlenememiş bile olan olasılıklar sağlamıştır. Bu yeni yöntemler temel araştırma, tarım, tıp, ekoloji, adli tıp ve diğer birçok alanda yapısal değişimler oluştururken toplumu, şaşırtıcı seçenekler ve önemli etik sorunlarla başbaşa bırakmaktadır.

Genetik seçim ve tarama ise daha sonra yer almaktadır ve bu bölümün son kısmı, bu teknolojinin çok geniş uygulama alanları ve potansiyelini açıklamaktadır.

DNA Klonlama: Temel Bilgiler

Klonlama, eş kopya yapmak demektir. Bu terim başlangıçta bir hücrenin izole edilerek, araştırma yapmak üzere yeni ortamda üretilmesiyle eş hücre populasyonunun oluşturulması işlemine uygulanmıştır. DNA klonlama, büyük bir kromozomdan özgül bir gen veya DNA parçasının ayrılarak taşıyıcı küçük bir DNA molekülüne bağlanması ve sonra bu değişen DNA’mn binlerce, milyonlarca kez kopyalanmasıdır. Böylece hem hücre sayısı ve hem de klonlanmış DNA’mn her bir hücrede çoklu kopyalarının meydana getirilmesi gerçekleşmektedir. Sonuç özel bir gen ya da DNA parçasının sayısının seçici olarak artırılmasıdır. Herhangi bir organizmadan DNA klonlaması, beş genel yöntemi kapsar:

  1. DNA’nın belli bölgelerden kesilmesi. Diziye özgül endonükle- azlar (restriksiyon endonükleazlar) gerekli moleküler makaslamayı sağlar.

  2. İki DNA parçasının kovalent bağlanması. Bunu DNA ligaz gerçekleştirir.

  3. Kendini çoğaltabilen küçük bir DNA molekülünün seçimi. Klordanacak DNA parçaları plazmitlere veya viral DNA’lara (klonlama vektörleri; vektör gen aktarımı yapan bir ajandır) bağlanabilir, iki veya daha fazla kaynaktan sağlanan kovalent bağlı parçaları içeren bileşik DNA molekülleri rekombi- nant DNA’lar olarak adlandırılır.

  4. Rekombinant DNA’mn test tübünden alınarak, DNA replikas- yonu için enzimatilc ortam sağlayan bir konakçı hücreye sokulması.

  5. Rekombinant DNA içeren konakçı hücrelerin seçilmesi veya tanımlanması.

Bu ve benzer görevleri yapmak için kullanılan yöntemler topluca rekombinant DNA teknolojisi veya daha resmi olarak genetik mühendislik olarak belirtilmektedir. Bu başlangıç tartışmamızın çoğu, rekombinant DNA çalışmasında ilk kullanılan organizma ve halen en yaygm konakçı olan, Escheıichia coli bakterisindeki DNA klonlanması üzerinde odaklanacaktır. E.colinin pekçok üstünlüğü vardır. DNA’sının metabolizması (ve diğer birçok biyokimyasal süreçler) çok iyi anlaşılmıştır, pek çok doğal şekilde bulunan ve E.coli ile ilişkide olan klonlama vektörleri, örneğin, bakteriyofajlar ve plazmitler, iyi tanımlanmıştır; ve bir bakteri hücresinden diğerine DNA’mn taşınmasında etkin teknikler bulunmaktadır. Diğer organizmalardaki DNA klonlaması, bölümün sonlarında yer almaktadır.

Restriksiyon Endonükleazlar ve DNA Ligaz Rekombinant DNA’yı Oluşturmaktadır

Nükleik asit metabolizması üzerindeki onlarca yıldır süren çalışmaların bir sonucu olan bir dizi enzimin varlığı, rekombinant DNA teknolojisi için çok önemlidir.İki sınıf enzim bir rekombinant; DNA molekülünün oluşturulması ve yayılmasına genel yaklaşımda canlı alıcı noktada yeralır. Birincisi, tip II restriksiyon endonükleazlar, DNA’yı özgül DNA dizilerinden yerlerden keserek, bir dizi küçük parçalar oluşturur. İkincisi, klonlanacak DNA parçası, uygun bir klonlama vektörü ile bir araya getirildiğinde, DNA moleküllerinin birimiyle bağlanmalarım sağlayan DNA ligazlardır. Rekombinant vektör daha sonra, pek çok nesil boyunca hücre bölünmesi geçirdikçe parçanın sayısını artıran bir konakçı hücreye sokulur.

Restriksiyon endonükleazlar çok geniş sayıdaki bakteri türlerinde bulunmaktadır. Werner Arber bu enzimlerin yabancı DNA’yı (örneğin enfeksiyon yapan bir virüsün DNA’sı) tanımak ve kesmek gibi işlevleri olduğunu bulmuştur. Böyle bir DNA’ya kısıtlı (restricted) DNA denilen konakçı hücre DNA’sında restriksiyon endonükleazlarca tanınabilecek diziler özgül bir metilaz enziminin katalizlediği DNA metillemesiyle, sindirime uğramaktan korunur. Bakterilerdeki restriksiyon endonükleaz ve buna uygun metilaz, bazen restriksiyon modifikasyon sistemi olarak tanımlanır.

I, II ve III şeklinde belirtilen üç tip restriksiyon endonükleaz enzimi vardır. Tip I ve III genelde büyük ve çok altbirimli bileşikler olup, endonükleaz ve metilaz aktivitelerini içerir. Tip I restriksiyon endonükleazlar, DNA’yı tanıma yelinden 1,000 baz çiftinden daha uzakta olabilen rasgele yerlerden keser. Tip III restriksiyon endonükleazlar, DNA’yı tanıma yerinden yaklaşık 25 baz çifti uzaklıkta keser. Her iki tip restriksiyon endonükleaz da ATP enerjisi gereksinen bir tepkimeyle DNA boyunca ilerler, ilk kez Hamilton Smith tarafından izole edilen tip II restriksiyon endonükleazlar basit olup ATP’ye gereksinmez; DNA’yı tanıma yerinden keser. Bu enzimleri olağan dışı bir amaçla; gen ve genomların haritalanması ve analizleri için yeni yöntemleri geliştirmek üzere ilk kullanan, Daniel Nathans olmuştur.

Farklı bakteri türlerinde binlerce restriksiyon endonükleaz enzimi keşfedilmiştir. Bu enzimlerin bir ya da daha fazlasının kullanılmasıyla 100’den fazla farklı DNA dizisi tanımlanmıştır. Tanımlanmış diziler, dört ya da altı baz çift uzunluğunda ve palindromiktir. Bazı tip II restriksiyon endonükleazlarınca tanımlanan birkaç dizi gösterilmiştir. Bir restriksiyon endonükleaz hedefi olan DNA dizisi arasındaki etkileşime ilişkin moleküler ayrıntı, birkaç örnekte çok iyi bir şekilde gösterilmiştir. Tip II restriksiyon endonükleaz EcoRV ve hedeflediği diziyi kapsayan kompleks gösterilmektedir.

Bazı restriksiyon endonükleazlar, kesim sonunda her bir sarmal için iki ya da dört nükleotitli eşleşmemiş uçlar bırakarak çift sarmallı DNA’yı keser. Bu uçlara yapışkan uçlar denir. Çünkü birbiriyle ya da diğer DNA parçalarının yapışkan uçlarıyla baz eşleşimi yapabilir. Diğer restriksiyon endonükleazlar çift sarmal DNA’yı birbirine karşıt fosfodiester bağlarından keserken, iliç eşleşmemiş uç bırakmaz. Bu durum çoğu kez küt uçlar olarak bilinir.

Genomilc DNA’nın bir restrilcsiyon endonüklezla kesilmesiyle oluşan DNA parçalarmm sayısı, o özel restrilcsiyon yerinin DNA molekülündeki sıklığına bağlıdır; bu da büyüle ölçüde tanıma yerinin büyüklüğüne bağlıdır. Rastgele dizili bir DNA molekülünde tüm dört nükleotidin eşit şekilde dağıldığını varsayarsak, BamHl gibi bir restrilcsiyon endonükleaz tarafından tanınan altı baz çiftlik dizi, her 4Ü (4,096) baz çiftinde bir bulunacaktır. Dört baz çifti dizisini tanıyan enzimler, rasgele dizilimli bir DNA molekülünde daha küçük parçalar meydana getirecektir. Bu büyüklükteki bir tanıma yerinin her 44 (256) baz çiftinde bir kez bulunması beklenmektedir. Özel tanıma dizileri daha az sıklıkla bulunmaktadır, çünkü DNA’daki nükleotit dizileri rasgele değüdir ve dört nükleotit eşit şekilde dağılmamıştır. Büyük bir DNA’run restrilcsiyon endonükleaz tarafından kesilmesiyle oluşan parçaların ortalama büyüklüğü, basit olarak tepkimeyi tamamlanmadan durdurarak artırılabilir; sonuç, kısmi sindirimdir.

DNA molekülü küçük parçalar vermek üzere kesildiğinde, büyüklüğü bilinen özel bir parça agaroz veya akrilamit jel elektroforezi ya da HPLC kullanarak zenginleştirilebilir. Tipik bir memeli genomunun bir restrilcsiyon endonükleazla kesilmesi genellilde çok fazla sayıda farklı parça ortaya çıkacağından; pratikte özel bir DNA parçasının elektroforez ya da HPLC ile izole edilmesi olası değildir. Özgül bir genin ya da ilgilenilen DNA parçasının klonlanmasmdaki ara basamak, sıklıkla bir DNA kütüphanesinin (bu bölümün sonlarında tanımlanmıştır) kurulmasıdır.

Hedeflenen DNA parçası izole edildiğinde, DNA ligaz enzimi kullanarak benzer şekilde kesilmiş klonlama vektörüne bağlamı. Karşılık gelen tamamlayıcı yapışkan uçların baz eşleşmeleri bu bağlama tepkimesini kolaylaştırır. Eco-RI tarafmdan oluşturulan bir DNA parçası, BamHl tarafından oluşturulan parçayla bağlanmayacaktu. Küt uçlar da, ancak daha az verimlilikle, bağlanabilir. Bağlanmakta olan uçlar araşma sente- tüc DNA parçaları (bağlayıcılar denir) sokularak, yeni DNA dizileri oluşturulabilir. Restrilcsiyon endonükleazlar için çoklu tanıma dizilerine sahip DNA parçalama (daha soma ek DNA’nm kırılma ve bağlanmayla sokulduğu noktalar olarak yararlıdır), çoklu bağlayıcılar adı verilmektedir.

İki DNA parçasının seçici bir şekilde bağlanmalarında yapışkan uçların etkinliği, relcombinant DNA’nın ilk uygulamalarında görülmüştür. Restrilcsiyon endonükleazlarm fazla çeşidinin olmadığı dönemlerde, bazı araştırmacılar balcteriyofaj X elcsonülcleaz ve terminal transferaz enzimlerinin ortak etkisiyle yapışkan uçların meydana getirilebildiğim bulmuşlardı. Birleşecek parçalara tamamlayıcı homopolimerilc kuyruklar verilir. Bu yöntem ille kez 1971 yıhnda Peter Lobban ve Dale Kaiser tarafmdan, doğal DNA parçalarmm birleştirilmesi deneylerinde kullanılmıştır. Benzer yöntemler daha sonra Paul Berg tarafından, balcteriyofaj AMan elde edilen DNA’ya simian virüsü 40 (SV40)’tan alman DNA parçalarmm bağlanması için kullanılmıştır, böylece farklı türlerden elde edilen DNA parçalarım içeren ilk re- kombinant DNA meydana getirilmiştir.

Klonlama Vektörleri Aldıkları DNA Parçalarının Çoğalmasına İzin Verir

Bir konakçı hücreye klonlanabilecek biçimde bir relcombinant DNA molekülünün verilmesini ve sonra orada çoğalmasını yöneten ilkeler, E.coli deneylerinde yaygm şekilde kullanılan üç klonlama vektörünü, plazmitler, balcteriyofajlar ve bakteri yapay kromozomları, inceleyerek görülebilir. Plazmitler konakçı hücreden bağımsız olarak kendini çoğaltan iki ucu kapalı dairesel DNA molekülleridir. Doğal bakteri plazmitleri 5,000-400,000 arası baz çifti büyüklüğündedir. Bunlar transformasyon adı verilen bir süreçle bakteri hücrelerine sokulabilir. DNA’nın hücreler tarafından alınması için, hücreler ve plazmit DNA birlikte 0°C’de kalsiyum klorür çözeltisinde bekletilir ve sonra sıcaklık hızla 37-43 °C’ye getirilerek şoka maruz bnakılır. Çok iyi anlaşılmayan nedenlerle, bu yolla muamele görmüş hücrelerin bazüarı, DNA’yı almaktadır. Diğer bir yolla plazmit DNA ile hücreler birlikte yüksek voltaja maruz bırakılabilir. Elektroporasyon adı verilen bu yaklaşımla hücre zarı büyük moleküllere geçirgen kılınmaktadır.

Hangi yaklaşım olursa olsun hücreler plazmit DNA’yı gerçekten almaktadır ve alan hücreleri seçmek için ise bir yönteme gereksinilmektedir. Genel eğilim plazmidin, konakçı hücrenin özgül şartlar altında büyümesi için gereksindiği geni, örneğin bir antibiyotiğe direnç kazandıran bir geni içerdiğinden emin olmaktır. Sadece rekombinant plazmit ile dönüştürülmüş olan hücreler antibiyotikli besi ortamında çoğalırken plazmidi içeren herhangi bir hücreyi bu koşullarda “seçilebilen” yapmaktadır. Böyle bir gen bazen seçilebilen belirteç olarak adlandırılmaktadır.

Klonlama için uygun olan birçok farklı plazmit vektörü, doğal plazmitlerin değiştirilmesiyle meydana getirilmiştir. E. coli plazmidi pBR322, bir klonlama vektöründeki yararlı özellikleri içeren iyi bir örnektir :

  1. Plazmidi çoğaltmak ve bir hücrede 10 ile 20 arasmda kopyasının bulunması için bir replikasyon başlama bölgesine gereksi- nilmekteclir.

  2. Farklı antibiyotiklere karşı direnç sağlayan iki gen, değişmemiş plazmit ya da plazmidin rekombinant olmuş biçimini içeren hücrelerin tanımlanmasında yararlıdır.

  3. Farklı restriksiyon endonükleazlar için çeşitli özgül tanıma dizileri plazmidin, daha sonra yabancı DNA’nın sokulması için kesileceği yerleri sağlamaktadır.

  4. Yapının tümünün küçük boyutu, plazmidin hücrelerin içine gü’mesini ve DNA’nın biyokimyasal işlenmesini kolaylaştırmaktadır.

Saflaştmlmış DNA ile bakteri hücrelerinin dönüştürülmesi (hiçbir zaman çok verimli bir süreç değildir), plazmidin boyutu büyüdükçe azaln-; bu nedenle plazmitler vektör olarak kullanıldığında, 15,000 baz çiftinden daha uzun DNA parçalarının klonlanması zordur. Bakteriyofajlar Bakteriyofaj X, bir bakteriye 48,502 baz çiftlik bir DNA’nın verilmesinde çok verimli bir mekanizmaya sahiptn* ve biraz daha büyük DNA parçalarının klonlanmasmda vektör olarak kullanılabilir. Bunun kullanımım destekleyen iki anahtar özellik vardır:

  1. X genomunun yaklaşık üçte biri gereksiz bölgeler olup, yabancı DNA bu bölgelerin yerine geçebilir.

  2. Eğer bir DNA, yalnızca 40,000 ve 53,000 arası baz çifti uzunluğundaysa enfeksiyöz fajlara paketlenebilecektir. Bu uzunluk sadece rekombinant DNA’nın doğrudan paketlenmesi için zorlayıcı bir etken olarak kullanılabilir.

Geliştirilmiş bakteriyofaj X vektörleri, kolayca üç parçaya kesilebilir; sadece 30,000 baz çifti uzunluğunda olup önemli genleri içermektedir. Vektördeki üçüncü parça olan “dolgu" DNA ise, vektör klonlama için kullanılacağı zaman, atılır. Eklenecek DNA bu nedenle, uygun faj patiküllerini üretmek için yeterli uzunluktaki bağlı DNA moleküllerini oluşturmak üzere, iki gerekli parça araşma sokulmalıdır. Aslında paketleme mekanizması rekombinant viral DNA’ları seçmektedir. Bakteriyofaj X vektörleri, 23,000 baz çiftine kadar olan DNA parçalarının klonlanmasına izin vermektedir. Bakteriyofaj X parçaları, uygun büyüklükteki yabancı DNA parçalarına bir kez bağlandığında, oluşan rekombinant DNA’lar, bir fajm tam bir şekil alması için gereken tüm proteinleri kapsayan ham bakteri hücre özütlerine eklenmekle, faj partiküllerine paketlenebilir. Bu işleme in vitro paketleme adı verilir. Tüm uygun faj partücülleri yabancı DNA parçasını içerecektir. Rekombinant DNA’nın daha sonra E.coli hücrelerine transferi ise yüksek verimlilikle gerçekleşmektedir.

Yapay bakteri kromozomları (BAC’Iar), çok uzun DNA parçalarının klonlanması için düzenlenmiş basit plazmitlerdir. Genelde kloramfenilcole direnç (CmR) gibi seçilmiş belirteçler içerirler. Bunlarda ayrıca her
Kloram fenikol ve 1- galaktozidaz substratı içeren ağar kloramfenikole dirençli hücrelerin seçimi
hücrede bir ya da iki tane plazmidin olmasını sağlayan çok kararlı bil’ replikasyon başlangıcı (on) da bulunur. Birkaç yüz bin baz çifti uzunluğundaki DNA parçaları BAC vektör içinde klonlanır. Büyüle çembersel DNA’lar daha sonra elektroporasyonla konakçı bakterilere verilir. Rekombinant BAC’Iar için konakçı olarak kullanılan bakteriler, bu büyük DNA moleküllerinin hücre içine almma- larını kolaylaştırıcı hücre duvarlarını oluşturacak mutasyonlara sahiptir.

Tek bir gen bir kromozomun çok küçük bir parçası olduğundan, özel bir geni içeren DNA parçasının izole edilmesi için çoğu kez iki işlem gerekmektedir. Birincisinde, bir genomdan elde edilen binlerce DNA parçası içeren bir DNA kütüphanesi oluşturulur. İkincisinde, ügüenilen gem içeren DNA parçası, bunu diğer DNA parçalarında ayıran anahtar özelliği -dizisi- kullanılarak tanımlanır.

DNA kütüphaneleri DNA’nın kaynağına bağlı olarak çeşitli biçimlerde olabilir. En yaygm olan genomik kütüphane olup, bir organizmanın bir tam genomunun binlerce parçaya ayrıldığındaki durumdur ve hepsi de bir klonlama vektörüne verilerek klonlana- bilir. Birinci basamak’ta klonlanacak DNA bir restriksiyon endonükleaz kullanılarak, herhangi bir dizinin çeşitli büyüklükteki parçalarda ortaya çıkacağı, kısmi bir sindirime uğratılır. Parça büyüklüğü hem klonlama vektörüne ve hem de kütüphanede sunulacak hemen hemen tüm dizilere uygunluğu sağlanacak şekilde seçilir. Klonlama için çok küçük ya da çok büyük olan parçalar, santrifüjlemeyle veya elektroforezle uzaklaştırılır. Klonlama vektörü de restriksiyon endonümeazla kesilir ve genomik DNA parçalarına eklenir. Bağlı DNA karışımı, bakteri hücrelerini dönüştürmek veya bakteriyofaj partiküllerine paketlenmek üzere kullanılmaktadır. Böylece bakteri ya da fajın her bni farklı rekombinant DNA molekülünü almış olur, ideal olarak genomdaki tüm DNA kütüphanede temsil edilecektir.

Dönüştürülen her bir bakteri, aynı rekombmant plazmidi taşıyan eş hücreler kolonisi ya da “klonu” verir. Bir bakteriyofaj vektörü kullanıldığında, her rekombinant faj tipi, ağar plaka üzerinde düzgün bir şekilde dağılmış bakteri üreme yerlerinde, lizize uğramış hücrelerce saydam bölge (plak) oluşturur. Bu saha içindeki rekombinant bakteriyofajların hepsi bü’birinin aynıdır. Sonraki hedef, kütüphanedeki binlerce klon arasından ilgilenilen geni içeren klonu tanımlamaktır. Sorunun boyutu hakkında bn Fikir edinmek için, 3 x 10E) DNA baz çiftinden oluşan bir memeli genomunu düşününüz. Eğer BAC’ler klonlama vektörü olarak kullanılırsa ve özel dizili bir genin kütüphanede temsü edilme olasılığı da %99 ise, o zaman kütüphane, her birine 300,000 baz çifti sokulmuş yaklaşık 50,000 rekombinant BAC içermelidir.

Yüksek ökaryottan türemiş bir genomik kütüphanedeki parçalar, sadece genlerden oluşmaz; pek çok ökaryot genomunun büyüle bir kısmı, şifre olmayan DNA’dır. Çok daha özel ve eşsiz bir DNA kütüphanesi, belli bir organizmada ve hatta belli hücre veya dokularda ifadelenen genlerden oluşturulabilir. İfadelenmiş genler, RNA’ya yazılmış olanlardır. Bir organizmadan ya da bir organizmanın belli hücrelerinden elde edilen bir mRNA önce ayrılır; sonra çok basamaklı bir tepkimeyi katalizleyen ters transkriptazın etkisiyle bu RNA’dan komplementer DNA’lar (cDNA’lar) oluşturulur. Ortaya çücan çift sarmallı DNA parçaları sonra, c DNA kütüphanesi denilen bir klonlar topluluğu oluşturmak üzere, uygun bir vektöre verilir ve klonlarur. Özel bir gen için araştırma, bu geni ifadeleyen hücrenin mRNATarmda ortaya çıkarılmış cDNA kütüphanesi üzerine odaklanarak yapılır. Örneğin globin genlerinin klonlanması, mRNATarımn yarısı globinler için şifre olan eritrosit öncülü hücrelerden bir cDNA kütüphanesi oluşturularak yapılır.

İnsan genom projesi ve her tip organizmanın genomlarının sırala- nımını belirlemeye ilişkin çalışmalar, çok özgün gen sırası bilgilerini açığa çıkarmaktadır. Oysa bir ya da daha fazla DNA kütüphanelerinin
oluşturulması, bir genomun dizisinin belirlenmesinde çoğu kez bir ara basamaktır. Genomik dizinin belirlenmesi tamamlandığında, bil’ genin kütüphanenin yardımı olmaksızın kolayca klonlanabildiği görülecektir. Eğer klonlanacak bir DNA parçasının en azından bir kısmına ait dizi bilinirse, o DNA bölümünün çok sayıdaki kopyası, polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanılarak çıkarılabilir. 1983 yılında Kary Mullis tarafmdan keşfedilen PCR Üe çoğaltılmış DNA doğrudan klonlanabilmekte ya da çeşitli analitik işlemlerde kullanılabilmektedir.

PCR şık bir yalınlığa sahiptir. İki sentetik oligonükleotit sentez- lenir; bunların her biri, çoğaltılacak bölümün uçlarının hemen yanındaki yerlerdeki hedef DNA’nın karşıt sarmallarındaki sıralara komplementerdir. Oligonükleotitler replikasyonun primerleri olarak görev yapar; hibritleşmiş probların 3’ uçlarıyla birbirlerine karşı konuşlanmış ve istenen DNA parçası boyunca DNA sentezini başlatmak üzere yerleşmiştir.
Çoğaltılacak bölümü içeren izole DNA, önce hafif şekilde ısıtılarak denatüre edilir, sonra sentetik oligonüldeotitlerin çok fazla bulunduğu ortamda soğutulur. Daha sonra dört tip deolcsinükle ozit trifosfat eklenir ve primerli DNA bölümü seçicilikle kopyalanır. Isıtma, soğutma ve replikasyondan oluşan bir döngü, birkaç saat içinde otomatik işlemle 25-30 kez tekrarlar, primerlerin takılı olduğu bu DNA bölgesinin kolayca analizi ve/veya klortlanabilmesi için çok sayıda kopyası çıkarılmış olur. PCR’da taql polimeraz (90°C’de yaşayan bir bakteriden elde edilmiştir) gibi ısıya dayanıldı polimerazlar kullanılır. Enzim her ısıtma basamağında aktif kaldığı için yenilenmesine gerek yoktur. PCR için kullanılan primerlerin titiz tasarımı örneğin endonükleaz kesim yerlerinin dahil edilmesi, çoğaltılmış DNA’nın sonraki klonlanmasını kolaylaştırmaktadır.

PCR yöntemi hemen her örneğin saptanması ve çoğaltılması için yeterince hassastır. DNA yavaş şekilde yıkılmasına karşm, 40,000 yaşmdan fazla örneklerden alman DNA’lar PCR yardımıyla başarıyla klorü arınmıştır. Bu teknik, mumyalanmış insan kalıntılarından ve yünlü mamut gibi soyu tükenmiş hayvanlardan alman DNA parçalarının klonlanması için kullanılmıştır. Böylece moleküler arkeoloji ve moleküler paleontoloji gibi yeni bilim dalları ortaya çıkmıştır. Defin yerlerinden sağlanan DNA; PCR yöntemi ile çoğaltılarak, eski insanların göç yollan izlenmektedir. Epidemiyologlar, insan patojende virüslerinin evrimini incelemek için insan kalmtdarmdan PCRİa çoğaltdan DNA örneklerini kullanabilirler DNA klonlamadaki yararlarına ek olarak PCR’nin, add tıpta da çok önendi yeni bir araç olduğu anlaşılmıştır. Bu teknik, hastalık daha ortaya çıkmadan viral enfeksiyonların belirlenmesinde ve bir grup genetik hastalığın prenatal tanısında da kullanılmaktadır.

DNA hibritleşmesi, özel bir genin ya da nükledc asit bölümünün saptanması için en yaygm kullanılan dizi temeüi bir süreçtir. Yöntem çeşitli değişikler içerir; en önemlisi, çözümlenen DNA’yı tamamlayıcı işareti (örneğin radyoaktif) DNA ya da RNA parçasının bir prob olarak kullanmasıdır. DNA kütüphanesindeki özel bir DNA dizisini saptamada kudandan klasik bir yaklaşımda; nitroselüloz kağıt, kütüphanedeki her biri farklı rekombinant DNA içeren pekçok bakteri kolonisine sahip ağar plaka üzerine bastırılır. Her bir koloniden bazı hücreler kağıda geçer ve dolayısıyla plakanın bir kopyası kağıda geçirilmiş olur. Kağıt adcad de muamele ederek hücreler yıkılır ve içlerindeki DNA denatüre edilir. Bu DNA geldiği koloni çevresindeki kağıda bağlanmış olur. Daha sonra radyoaktif DNA probu kağıda eklenir; prob, sadece tamamlayıcı DNA de hibritleşir. Eşleşmemiş prob DNA’sı yıkanmayla uzaklaştırldıktan sonra, hibridleşmiş DNA otoradyografiyle saptanabilir.

DNA Mikrosıraları Genlerin ve İfadelenmelerinin Çalışılmasında Sıkıştırılmış Kütüphaneleri Sağlar

Genom dizi projelerinden gelen DNA dizi bilgileri bir gerçeği ortaya çıkarmıştır. Yıllardır biyokimya alanındaki ilerlemelere karşın, her ökaryotik hücredeki binlerce gen (ve bakterilerde bile oldukça fazlası) hakkında hala hiçbir şey bilmiyoruz. Genomik dizi verilerini hızlı taramak ve gen işlevine ait ipuçlarını elde etmek için yeni yöntemler gereklidir. DNA kütüphaneleri, PCR ve hibritleşme teknolojisindeki yeni düzenlemelerin birlikte değerlendirilmesiyle, binlerce genin hızlı ve aynı anda taranmasını sağlayan DNA mikrosıraları (bazen DNA çipleri de denmektedir) geliştirilmiştir. Bilinen genlere ait, birkaç düzineden yüzlercesine nükleotit uzunluğundaki DNA bölümleri, nanolitre miktardaki DNA çözeltisini doğru şekilde bırakan robotlar kullanarak, katı bir yüzeydeki noktalara yerleştirilir. Böyle noktaların binlercesi, sadece birkaç santimetrekarelik bir yüzey üzerindeki öntasarındı sıra içinde yerleşiktir. Bu tekniğin çarpıcı bir örneği bu kitabın Kısım IV’ün başında görülmektedir. Dizisi tümüyle belirlenmiş maya genomundaki 6000’den fazla genin her birinden bölümler, PCR ile ayrı ayrı çoğaltılmış ve her biri belirli bir örnek çerçevesinde bu mikrosırayı oluşturmak üzere bırakılmıştır. Bir diğer yol katı yüzey üzerinde doğrudan DNA sentezlemektir.

Mikrosıra, bir organizmamn gelişiminin herhangi bir döneminde hangi genlerin ifadelendiği sorularına yamt verebilmektedir. mRNA’nm toplam komplemam gelişimin iki farklı basamağındaki hücrelerden izole edilir ve ters transkriptaz ve floresan işaretli de- oksinükleotitler kullanarak cDNA’ya dönüştürülür. Floresan cDNAlar karıştırılır ve prob olarak kullanılırsa, her biri mikrosıra üzerindeki tamamlayıcı dizileriyle hibritleşir. Bu örnekte her bir örnek için cDNA yapmakta kullanılan işaretli nükleotitler iki farklı renkte floresans verilir, iki örnekten cDNA karıştırılır ve mikrosırayı problamak üzere kulanılır. Yeşil floresan veren noktalar, tek hücre basamağmda bol olan mRNAİarı temsil etmektedir. Kırmızı floresan verenler ise, gelişmenin son döneminde dalıa fazla olan dizüeri temsil etmektedir. Dizilerin mutlak fazlalığını değil de göreli ilişkisini ölçmek üzere iki örnek karışımı kullanılarak, grid üzerindeki her bir noktada orijinalde bırakılan DNA miktarlarındaki değişimler ve mikrosırada bir noktadan diğerine var olan diğer tutarsızlıklar düzeltilir. Floresan veren noktalar, hücrelerin izole edildiği anda ifadelenmekte olan tüm genlerinin fotoğraflarım verirken, gen ifadelenmesi genom genişliği ölçeğinde incelenmiş olur. İşlevi bilinmeyen bir gen için, o genin ifadelenmesinin zamanı ve koşulları, hücredeki rolü hakkında önemli ipuçları verir.

Rekombinant DNA Teknolojisi Uygulamaları

images

Bir genin klonlanması, protein ürününün büyük miktarlardaki üretimi gibi çok daha büyük bir tasarımda, sadece ilk basamaktır, ilgili proteinin amino asit dizisi, gende baz çifti değişimleri yaparak değiştirilebilir. Bu yaklaşım; proteinin katlanması, yapısı ve işlevinin araştırılmasında çok etkin olabilir. Tüm hücre tiplerinin içine ve dışına DNA’nın yönlendirilmesi için gelişmekte olan çok hassas yöntemler, genin işlevi ve düzenlenmesinin incelenmesi için ve bitki ve hayvanlara yeni özelliklerin kazandırılması için yeni olasılıklar sağlamaktadır.

Şimdi klonlanmış genlerin ürettiği proteinlerle başlayarak DNA klonlanmasmın uygulamalarma dönelim. Soma çeşitli ökaryot hücreler için kullanılan klonlama yöntemlerinden söz edeceğiz. Bu teknolojinin potansiyeli ve ilintilerini değerlendiren bir özetle bitireceğiz.

Klonlanmış Genler İfadelenebilir

Aslında asıl ilgilenilen klonlanmış genin kendinden çok protein ürünüdür. Özellikle proteinin ticari, tedavi edici ya da araştırma değeri olan bir ürün özelliği varsa bu çok daha ilginçtir. DNA, RNA ve protein metabolizmasının temelleri ve bunların E.coli’deki düzenlenmesinin anlaşılması, protein ürünlerinin incelenmesi için klonlanmış genlerin ifadelenmelerini sağlamıştır.

Ökaryot genlerin pek çoğu, E.coli hücreleri içinde ifadelenmeleri için gerekli olan DNA dizi öğelerinden (promotörler gibi) yoksundur. Bu balamdan, yazım ve çeviri için bakteri kökenli düzenleyici dizilerin, vektör DNA’daki ökaryot gene yakın konumlarda yerleştirilmeleri gerekmektedir. Klonlanmış genler bazı durumlarda o kadar yeterli ifadelenirler İd, protein ürünleri hücre proteinin % 10 ya da daha fazlasını oluştur. Bazı yabancı proteinler, derişimleri bu kadar yüksek olduğunda E.coli’yi öldürebilir; gen ifadelenmesi hücrelerin planlanmış ürün alma zamanından birkaç saat öncesiyle sınırlanmalıdır.
Klonlanmış genin böyle düzenlenmiş ifadelenmesi için gerekli yazım ve çeviri sinyalleri olan klonlama vektörlerine çoğu kez ekspresyon vektörleri adı verilir. Klonlanmış genin ifadelenme hızı, genin kendi promotor ve düzenleyici dizilerinin vektörce temin edilen daha etkin ve uygun olanlarla değiştirilerek denetlenebilir. Genelde, çok iyi tanımlanmıştır promotör ve onun düzenleyici öğeleri klonlama için çeşitli özgün restriksiyon yerlerine yakın yerleştirilir. Böylece, restriksiyon yerlerinde yerleştirilen bu genlerin ifadelenmesi düzenlenmiş promotörden olacaktır. Bu vektörlerin bazıları diğer özellikleri de içerir; örneğin, genden türemiş mRNA’nın çevirisini artırmak üzere bakteri ribozomunun bağlanma yerleri ve/veya yazım sonlandıran dizi gibi. Bakteri ve diğer hücrelerde klonlanmış genin fazla ifadelenmesi, özgül proteinlerin çok fazla miktarlarını oluşturabilir, bu durumda ya araştırıcıların işlerini kolaylaştırabilir ya da endüstri için yüksek verim sağlar.

Klonlanmış Genler Değiştirilebilir

Klonlama teknikleri proteinlerin fazla üretimleri içm değil, doğal halleri incelikle değiştirilmiş proteinleri de üretmek için kullanılabilir. Özgül amino asitler, yere yönelik mutagenezle tek tek yer değişikliğine uğratabilir. Protein yapı ve işlevini incelemedeki bu güçlü yaklaşım, klonlanmış genin DNA dizisini değiştirmekle proteinin amino asit dizisini değiştirmektedir.

Eğer restriksiyon yerleri değiştirilecek dizinin yan tarafında ise; değişim basitçe DNA bölümünün uzaklaştırılması ile yapılır. Yerine, istenen değişim dışında orijinalin aynısı olan sentetik dizi konur. Eğer uygun şekilde yerleştirilmiş restriksiyon yerleri yoksa, oligonümeotit yöneltili mutagenez adı verilen bir yaklaşım özgül DNA cüzisi değişimini oluşturmak için kullanılabilir. Özgül baz değişikliği olan kısa sentetik DNA uygun vektör içinde klonlanan genin tek sarmallı kopyasına bağlanır. 15-20 baz çiftinden tek bir çiftin eşleşmemiş olması, uygun sıcaklıkta yapılması koşuluyla bağlanmayı etkilemez. Bu bağlı sarmal, plazmit vektöre tamamlayıcı sarmalın sentezi için bir primer plarak görev yapar. Bu hafif şekilde eşleşmemiş çift sarmallı rekombinant plazmidi, bakterileri değiştirmek üzere kullanılır. Bu eşleşmemiş durum bakteri DNA tamir enzimleriyle düzeltilir. Tamir olaylarının yaklaşık yarısı, değişen bazı uzaklaştırarak yerine doğrusunu koyar. Genin orijinal dizisi yeniden kurulmuş olur. Diğer yarısı ise, noımal bazı uzaklaştırır ve yerine yenisini koyarken istenen mutasyon sağlanmış olur. Değişmiş bakteriler, değişmiş cüziyi içeren bir plazmidi barındıran bakteri kolonisine rastlayana kadar taranır (plazmit DNA’larmın dizisine bakarak).
Bir baz çiftinden fazlasını da içeren değişimler oluşturulabilir. Genin büyük kısımlarının delesyonu genin bir bölümünün restriksiyon endonüklezlarla kesilip çıkarılması ve sonra daha küçük bir gen oluşturmak üzere kalan bölüm birleştirilmesiyle gerçekleştiri- lebiür. İki farklı genin kısımları yeni bileşimler oluşturmak üzere bağlanabilir.

Aslında her hangi bir genetik değişikliği in vitro oluşturmak içm çok görkenüi yöntemler bulunmaktadır. Hücreye değişmiş geni vermekle, değişimin sonuçlarını inceleme şansı doğmaktadır. Yere yönelik mutagenez proteinler üzerinde yapılan araştırmaları kolaylaştırmıştır. Araştırmacılar bir proteinin primer yapısmda özgül bir değişiklik yapabilmekte; bu değişildiğin proteinin katlanması, üç boyutlu yapısı ve işlevi üzerindeki etküerini inceleyebilmektedir. Bu yöntemler, aktivitesi artırılmış veya sıcaklık ve pH derecesinin uç noktalarında, ya da organik çözücüler gibi sert çevre koşullarında işlev yeteneği olan proteinlerin yapılması için ticari şekilde kullanılmaktadır.

Maya Rekombinant DNA İçin Önemli Bir Ökaryoiik Konakçıdır

Genetik mühendisliği çalışmalarında konakçı olarak kullanılan hücreler sadece E.coli hücreleri değildir. Mayalar bu iş için özellikle uygun ökaryotik hücrelerdir. E.coli’de olduğu gibi maya genetiği de iyi gelişmiş bir disiplindir. En yaygm kullanılan maya, Saccharomyces cerevisiae, sadece 14 x 106 baz çiftinden (E.coli kromozomunun 4 katma yakın ve ökaryot standartlarına göre basit bir genom) oluşan bir genoma sahiptir ve nükleotit dizisi tümüyle bilinmektedir ve nihayet bir mikroorganizma olduğu için laboratuvarda büyüle miktarlarda çoğaltılması ve bakımı çok kolaydır.

Yukarıda tanımlanan E.coli vektörlerinin kullanımındaki ilkeler kullanılarak maya için ifadelenme vektörleri yapılmıştır. Pek çok ökaryotik protein, bakterilerde bulunmayan enzimler tarafmdan sentez soması değişikliğe uğradıklarından; bakterilerde oluşturulan ökaryot proteinler, aktiviteleri için gerekli değişikliklerden yoksundur. Mayalarm içine ve dışına DNA’nın yönlenmesi için şimdi varolan uygun yöntemlerin kullanılmasıyla, ökaryot hücre biyokimyasının birçok yönünün çalışması kolaylaşmıştır. Dönüşmüş maya hücrelerinde, sokulan DNA homolog rekombinasyonla hücre kromozomuna katılabilmektedir. Bu integratif dönüştürüm düşük sıklıkta gerçekleşir.

Dönüştürüm verimliliği, mayada replikasyon yeteneğindeki plazmide klonlanmış DNA sokularak artırılabilir. 2 mikron (2/rm) uzunluğundaki doğal maya plazmidi, çeşitli klonlama vektörlerinin oluşturmak üzere genetik mühendilikçe işlenmiştir. Bu vektörlerin replikasyon orijinleri ve diğer öğelerinin olmasıyla, birden fazla türde (örneğin, maya, ya da E.coli) bulunmalarına izin verilir, iki ya da daha fazla farklı türde çoğalabilen plazmitlere mekik vektörler denir.

Yapay Maya Kromozomlarında Klonlanabilir

Büyük DNA bölümlerini yerleştirme yeteneğindeki bir klonlama vektörü, bir organizmanın genomunu bir genomilc DNA kütüphanesi şeklinde arşivlemek için gerekli olan klon sayısını azaltmaktadır, böylece özel bir geni içeren klonu tanımlamak için taranması gereken sayı azalmaktadır. Büyük genomlarla çalışmalar ve ilişkili olarak yüksek kapasiteli klonlama vektörlerine gereksinim, yapay maya kromozomlarının geliştirilmesine yol açmıştır.

YAC vektörleri, bir maya çekirdeği içinde ökaryot kromozomu bulundurmak üzere gerekli tüm öğeleri içermektedir. Bunlar, maya replikasyon orijini, sentromer, telomerler ve seçilebilen iki belirteçtir. Vektör klonlamada kullanılmadan önce, bir dairesel plazmit şeklinde çoğaltılır. Bir restriksiyon endonükleaz ile kesimi, iki telomer dizi arasındaki DNA uzunluğunu ortadan kaldırır iki ucunda telomeri olan doğrusal bir DNA meydana getirilir. Diğer bir iç kısım kesim vektör iki DNA parçasına ayrılır. Bunlar her biri farklı seçilmiş belirteç içeren vektör kollandır.

Restriksiyon endonükleazların kısmi sindirimiyle genomik DNA hazırlanır. Genomik parçalar sonra, jel elektroforezinin bir tipi olan ve çok büyük DNA parçalarının ayrılmalarım sağlayan, pulsed alan jel elektroforezi ile birbirinden ayrılır. Uygun büyüklükteki DNA parçaları (yaklaşık 2 milyon baz çiftli), hazırlanmış vektör kollarıyla karıştırılarak bağlanır. Bağlama karışımı, daha sonra çok büyük DNA molekülleriyle muamele edikmiş maya hücrelerinin dönüştürümünde kullanılır. Kültür vasatında seçilebilen her iki belirteç genin de bulunması gerekir, çünkü maya hücresi, ancak iki vektör kolu araşma sokulmuş büyük geni içeren yapay kromozom içerirse çoğalır. YAC klonlatın kararlılığı bir noktaya kadar büyüklükle artabilir. Klonlanmak üzere yerleşmiş genin 150,000 baz çiftinden daha büyüle olanları normal hücre kromozomlarına yalan kararlılıkta iken, 100,000 baz çiftinden küçük olanlar mitoz sırasında kaybolur (böylece sadece birbiriyle bağlı ild vektör ucu ya da sadece kısa katılmalar içeren maya hücre klonlan genelde bulunmaz). İld ucundan birinde telomer olmayan YAC hızla parçalanır. YAC DNA kütüphaneleri ve klonlan büyük genomların çalışılmasında yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bunlar insan genommıa ait tüm dizinin belirlenme çalışmalarında ve birçok insan hastalığından sorumlu genlerin izole edilmesinde özellilde çok önemlidir.